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PCR-RFLP-SSCP及測序用于霍亂弧菌ctx-AB基因多態(tài)

2010-11-19 [1950]

 建立PCR-RFLP-SSCP及測序方法,用于分析霍亂弧菌腸毒素AB(ctx-AB)基因多態(tài)性。針對ctx-AB基因設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增片段為528bp,包括ctx-B編碼基因375bp,引物序列為5′-GGT GTA AAA TTC CTT GAC G-3′和5′-GGT TCG ATG ATG AGA AGC-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ酶切為317bp和211bp 2個(gè)片段。對酶切產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析,銀染色法顯示結(jié)果。對不同SSCP類型測序,利用PCR方法直接對PCR產(chǎn)物測序。


  霍亂弧菌O1群古典型(CVC)標(biāo)準(zhǔn)株569B和16017,埃爾托型(EVC)標(biāo)準(zhǔn)株919,O139群標(biāo)準(zhǔn)株MO45,EVC80株(廣東省90年代病人分離株),O139群10株(廣東省90年代病人分離株),由廣東省和廣州市衛(wèi)生防疫站提供。PCR擴(kuò)增ctx-AB基因,上述菌株均產(chǎn)生1條約528bp的片段,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ內(nèi)切酶消化后,在2%瓊脂糖凝膠上電泳,均可見1條約317bp的片段和1條約211bp的片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析,分為A和B兩個(gè)類型,CVC、EVC和O139群標(biāo)準(zhǔn)株均為A型,80株EVC(廣東省分離株)中8株為A型,其余為B型;O139群(廣東省分離株)均為A型。進(jìn)一步測序表明兩類型基因序列有3個(gè)位點(diǎn)不同,以ctx-B基因的起始堿基定位為1,其下游序列為正,上游序列為負(fù),兩類型在103、115和203位點(diǎn)堿基不同,A型為A、C和C(相應(yīng)位點(diǎn)編碼的氨基酸為Asp、Tyr和Ile),B型為G、T和T(相應(yīng)位點(diǎn)編碼的氨基酸為Asn、His和Thr)。與基因庫中霍亂弧菌的ctx-AB基因序列比較,B型103位點(diǎn)與國外報(bào)道的序列均不同,可能為廣東地區(qū)菌株*的突變。PCR-RFLP-SSCP及測序方法快速、簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì),適用于對大量標(biāo)本某重要基因多態(tài)性的研究

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