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激情盛夏,ELISA法檢測AB含量的方法

2018-07-27 [2265]

 ELISA),先將ABA蛋白質(zhì)復合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結(jié)合,然后將待測的ABA(樣品或規(guī)范品)和兔抗ABA抗體參加微量滴定板的孔中,進行競賽反響,接著棄去上清液,洗刷固相表面,參加酶標二抗使其與結(jié)合在固相ABA上的抗體反響,終去除剩余的未反響的酶標二抗,測定與固相結(jié)合的酶活性,酶活性和待測ABA含量呈負函數(shù)關(guān)系,即固相ABA結(jié)合的抗體與酶標二抗量(OD或B%)隨待測ABA含量添加而削減,以一系列已知濃度的ABA的OD值制圖而取得規(guī)范競賽性抑制曲線,關(guān)于不知道樣品B,只要在相同條件下測定反響后的OD值,就可以從規(guī)范曲線上查到ABA的量。
 測定辦法 ELISA辦法是一種固相抗原型酶聯(lián)免疫法(enzyme Linked Immuno Sorbent Assay 
1.包被:在微量滴定板內(nèi)參加100μLABA包被液,37℃濕盒過夜。 
2.標樣稀釋?:取8支試管每管加150μLDB,管中參加50μL(2000ng/50μL)規(guī)范液,充沛渦旋后,取50μL至第二號管中,相同渦旋后,取50μL到第三管;順次稀釋到第六管,稀釋后的規(guī)范ABA順次為1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。 
3. 洗板:從37℃濕盒中取出滴定板,康復到室溫后,棄去包被液,用WB(洗刷緩沖液)洗刷三次,甩干(吸水紙)。 
4.加樣:1~8孔對應(yīng)參加ABA標樣50μL,10號孔相應(yīng)參加濃ABA標樣,9號孔加50μLDB,三排重復;然后每孔加50μL抗體,37℃ 45分鐘。 
5.洗板: 
6.加酶標二抗:每孔加100μL,37℃反響1小時。 
7.洗板: 
8.顯色:各孔加10μLOPD顯色液,37℃ 20分鐘。 
9.停止反響:各孔加50μL 6NH2SO4。 
10.讀數(shù):490nm讀取OD值。其間10號孔調(diào)零,而9號孔為大值(B0),1~8號孔的OD值為B。

11.成果計算:以In(B/B0)∕(1-B/B0)為縱坐標,以規(guī)范ABA濃度的常用對數(shù)(lg[ABA])為橫坐標,繪制曲線。

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