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兔(Rabbit)腫瘤壞死因子a(TNF-a)ELISA 檢測試劑盒

2010-04-19 [2394]

 

兔TNF-α ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、緩沖液中細(xì)胞上清液及各種體液中的TNF-α 。本試劑盒可以檢測天然和重組的TNF-α 。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷。
 
試驗(yàn)原理
兔TNF-α 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知TNF-α 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將TNF-α 和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-α 的濃度呈比例關(guān)系。
 
試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份(2-8℃保存)
96孔配置
48孔配置
配制
96/48人份酶標(biāo)板
1塊板(96T)
半塊板(48T)
即用型
塑料膜板蓋
1塊
半塊
即用型
標(biāo)準(zhǔn)品:400pg/ml
1瓶(0.6ml)
1瓶(0.3ml)
按說明書進(jìn)行稀稀
空白對照
1瓶(1.0ml)
1瓶(0.5ml)
即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液
1瓶(5ml)
1瓶(2.5ml)
即用型
生物素標(biāo)記的抗TNF-α抗體
1瓶(6ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
親和鏈酶素-HRP
1瓶(10ml)
1瓶(5.0ml)
即用型
洗滌緩沖液
1瓶(60ml)
1瓶(30ml)
按說明書進(jìn)行稀釋
底物A
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
底物B
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
終止液
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型

 
自備材料
1. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
 
安全性
1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2. 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
 
 
 
操作注意事項(xiàng)
1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9. 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
 
樣品收集、處理及保存方法
1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
 
試劑的準(zhǔn)備
1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時準(zhǔn)備,不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:

400 pg/ml
(6號標(biāo)準(zhǔn)品)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
200 pg/ml
(5號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100 pg/ml
(4號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 pg/ml
(3號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 pg/ml
(2號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5 pg/ml
(1號標(biāo)準(zhǔn)品)
100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 pg/ml
(空白對照)
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

 
2. 洗滌緩沖液(20×)的稀釋:蒸餾水20倍稀釋。
 
操作步驟
1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
4. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
8. 取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。
 
建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

 
標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/ml)
 
A
400
400
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
B
200
200
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
C
100
100
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
D
50
50
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
E
25
25
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
F
12.5
12.5
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
G
0
0
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
H
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品

 
結(jié)果分析
以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的TNF-α 含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
 
局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。
 
試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
 
 
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