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淺談RT-PCR實驗方法中常見污染問題及對策

2010-07-19 [2015]

李軻反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)是一種體外核酸擴增技術(shù),它具有特異、敏感、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點,能在幾個小時內(nèi)完成從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴增出足量的目的產(chǎn)物供分析研究和檢測鑒定,所以近年來RT-PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人和動物的多種傳染病早期診斷。

筆者一直從事實驗室動物疫病檢測工作,現(xiàn)就應(yīng)用RT-PCR實驗方法過程中出現(xiàn)的一些常見污染問題做如下論述,僅共同行參考和探討。 RT-PCR實驗有三步:提取RNA、反轉(zhuǎn)錄(RT)、PCR擴增及擴增產(chǎn)物分析,在這一過程中,zui令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性。

污染原因主要有以下幾個方面: 

1、樣品間的交叉污染收集樣品的容器使用一次性的,如重復(fù)使用,應(yīng)在使用前應(yīng)于180℃的高溫下干烤6小時或更長時間;樣品存放時要密封嚴(yán)實,以防外溢造成相互間的交叉污染;樣品在提取過程中離心管及吸樣槍頭使用一次性的,以免不同實驗樣品間相互污染;由于吸樣槍污染會導(dǎo)致樣品間的污染,也是一個值得注意的問題,由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取時要十分小心,吸時要慢,吸取盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染;同時要注意操作時不要劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時也容易造成氣溶膠污染。若產(chǎn)生氣溶膠較多,會造成環(huán)境污染,不僅會導(dǎo)致實驗失敗,而且也會損害操作人員身體健康,因此每次實驗完畢都要及時清理實驗臺面,用0.5%次氯酸鈉消毒后再打開紫外燈照射半小時。 

2、RT-PCR本身使用的試劑污染在試劑配制過程中,由于加樣槍、容器及其它溶液被污染。因此所有試劑都應(yīng)盡量小量分裝,以減少重復(fù)加樣次數(shù),避免污染機會,另外RT-PCR試劑應(yīng)盡可能密封好分類存放。每次操作完畢后同樣要進行臺面消毒和紫外線照射消毒。 

3、擴增產(chǎn)物的污染這是實驗中zui常見的問題,極微量的擴增產(chǎn)物污染就可造成假陽性,每次實驗完后,擴增產(chǎn)物都要及時密封后處理。在做RT-PCR實驗時,一般都應(yīng)設(shè)陽性對照,操作不慎,污染可能性很大,因而當(dāng)某一RT-PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗人員經(jīng)驗豐富心中有數(shù)時,在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照,或間隔性設(shè)陽性對照,以減少污染機會。 

4、操作人員污染只要存在少量的RNA酶就會引起RNA的降解,從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,RNA酶可存在操作人員手汗、唾液中,也可灰塵中,一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染,容易造成實驗失敗,因此操作人員應(yīng)戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換,。設(shè)置PCR操作實驗室,所用實驗用具應(yīng)為,并合理分隔實驗室,將樣品的提取、配制RT-PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增等步驟分室進行,實驗前應(yīng)將實驗室及實驗人員工作服用紫外線或臭氧消毒以破壞殘留的DNA或RNA。任一種科學(xué)的實驗方法都有其自身完善和發(fā)展的過程,RT-PCR方法也不例外,在檢測質(zhì)量能保證的情況下,若能簡化樣品提取步驟或縮短其時間,減少擴增循環(huán)次數(shù),都能對防止污染有利。

總之,RT-PCR不管從特異性方面還是從靈敏性方面講都具有難以匹敵的優(yōu)勢,結(jié)果的可靠性和可信性應(yīng)該是的,是較具性的檢測方法,我們期待著它能盡快地自身完善和發(fā)展。


 

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