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噬菌體抗體ELISA

2011-10-15 [2221]

噬菌體抗體ELISA

噬菌體ELISA快速而便捷,尤其是因?yàn)閜Ⅷ有多拷貝會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的擴(kuò)增。不過(guò),后續(xù)的抗體檢測(cè)總是要以其可溶性形式進(jìn)行。

[器材和試劑]
● 96孔ELISA板,例如Nunc maxisorb442404(可自VWR購(gòu)得)
● 2%MPBS
● PBS/Tween
● 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的小鼠抗噬菌體單克隆抗體(mAb)(Amer Sham BiOSCiences)
● 3,3’,5,5’—四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液體底物系統(tǒng)(SigmaT—8665)
● 終止液(1mol/L H2SO4)
● 噬菌體樣品

[方法]
1.按每孔100ul蛋白抗原包被微量滴定板,4℃過(guò)夜。PBS中10ug/m1的濃度是包被抗原的標(biāo)準(zhǔn)濃度。但有時(shí)需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液(比如碳酸鹽緩沖液)。
2.棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。
3.加入200wl的2%MPBS封閉板孔,37℃孵育2小時(shí)。
4.用PBS洗滌板孔 3次。
5.每孔加入SOpl的4%MPBS。
6.每孔加入50ul含噬菌體抗體的培養(yǎng)基上清,用移液器反復(fù)吹吸混勻,室溫孵育1小時(shí)。
7.棄去溶液,用PBS/Tween洗滌板孔3次,再用PBS洗滌3次。
8.將HRP標(biāo)記的小鼠抗噬菌體單抗用2%MPBS按照1:5000稀釋后,每孔加入100ul;室溫孵育1小時(shí)。
9.棄去二抗,并用PBS/Tween和PBS分別洗滌3次。
10.每孔加入100ul TMB系統(tǒng)溶液,并在暗處室溫孵育10~30分鐘。數(shù)分鐘內(nèi),應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。
11.每孔加入50~100ul終止液,終止反應(yīng)。
12.在450nm處讀板。

除了用噬菌體(粒)進(jìn)行ELISA外,也可以用可溶性片段。在噬菌粒展示載體上抗體片段的表達(dá)受控于1acZ啟動(dòng)子。在無(wú)葡萄糖的條件下,可以終止1acZ啟動(dòng)子的代謝抑制作用,而它卻可為IPTG所誘導(dǎo)??贵w片段的表達(dá)是以一種被動(dòng)方式滲漏到上清中(部分原因是其對(duì)大腸桿菌所產(chǎn)生的毒性)的。應(yīng)當(dāng)注意的是,有些抗體片段,例如那些毒性不很大的抗體在外周質(zhì)中滯留的蛋白(甚至過(guò)夜培養(yǎng)后)比上清中所存在的要多些。

本處所述方法取決于起始培養(yǎng)基中可代謝的葡萄糖量(0.1%)在誘導(dǎo)劑(1PTG)加入時(shí)要足夠低。這可以避開(kāi)所有的離心步驟并降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。
 

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