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用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)步驟

2011-10-19 [2551]

用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)步驟

(1)將蓋玻片、載玻片或培養(yǎng)板置于水平面上;如為1h或1h以下的短程孵育,則勿需濕孵,可將蓋玻片或載玻片直接放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。多個(gè)蓋玻片則需置于Parafilm膜上,因?yàn)镻arafilm膜有彈性,能夠防止抗體溢出蓋玻片邊緣,也便于鑷子操作。但如果圓形蓋玻片數(shù)量過(guò)多,將其置于細(xì)胞生長(zhǎng)與固定的24孔培養(yǎng)板中。
如果孵育時(shí)間>1h,則需將其置于培養(yǎng)皿或濕盒中以利濕孵。有幾種方法可供放置蓋玻片或載玻片選用,以便于操作和濕孵,可依具體情況選用。例如,在培養(yǎng)皿上鋪一層水飽和的濾紙,再將載玻片置于濾紙上。蓋玻片亦可經(jīng)類似處理。如用24孔培養(yǎng)板,則需在板蓋上鋪一層潮濕的濾紙來(lái)保持濕度。
如孵育時(shí)間超過(guò)1h,可將抗體溶液加在Parafilm膜上的玻片上,再將蓋玻片或載玻片(樣品面朝-F)蓋在抗體溶液上。孵育完畢后用PBS洗滌。 用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)步驟

左為用蓋玻片在石蠟?zāi)ど喜僮饔覟樵?4孔板中操作
(2)加入一抗:加入足夠量的一抗使其覆蓋細(xì)胞,但不要溢出蓋玻片或載玻片邊緣,通常加入iotA。所有稀釋液必須用蛋白質(zhì)溶液配置,如3%BSA/PBS;
單克隆抗體通常為組織培養(yǎng)上清液(特異性抗體濃度為20~50ug/m1,未稀釋)。腹水、純化的單克隆和多克隆抗體以及粗制的多克隆血清應(yīng)該進(jìn)行稀釋度測(cè)定。如果特異性抗體的濃度是未知的,應(yīng)測(cè)試初始樣品的不同稀釋度(1:10,1:100,1:1 000,1:10 000)。
(3)蓋玻片、載玻片或平皿的孵育,在室溫下至少30 min。超過(guò)30 min則需濕孵或采用步驟(1)所述的方法。對(duì)于某些反應(yīng),將孵育時(shí)間延長(zhǎng)至12h,能夠提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度;
(4)PBS洗3次,每次5min以上;用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)步驟
PBS緩沖液中可以含1%TritonX-100或NP-40,以幫助解決背景問(wèn)題。
(5)加入HRP標(biāo)記的抗Ig抗體。這些試劑應(yīng)購(gòu)于有良好信譽(yù)的商業(yè)試劑公司。確認(rèn)所選擇的二抗是特異性針對(duì)一抗的種屬來(lái)源。例如,一抗如果來(lái)源于兔,則羊抗兔Ig將是一個(gè)很好的選擇。二抗應(yīng)該用含蛋白質(zhì)的溶液(如3%BSA/PBS)進(jìn)行稀釋。供應(yīng)商會(huì)建議合適的稀釋度,但如果沒(méi)有相關(guān)建議,可進(jìn)行二抗稀釋度測(cè)定,稀釋度范圍在1:10和1:1 000之間。
加入稀釋液的競(jìng)爭(zhēng)蛋白必須為非特異性抗體,其來(lái)源應(yīng)與標(biāo)記二抗一致,即同一種屬的動(dòng)物。例如,如果使用標(biāo)記的羊抗兔Ig,則稀釋液中須含1%的非免疫羊18(從非免疫動(dòng)物中分離及純化)。
(6)加入標(biāo)記的二級(jí)試劑后在室溫下孵育至少20min,但不應(yīng)超過(guò)1h;
(7)用PBS洗3次,每次5min以上。
(8)zui后一次洗滌時(shí),準(zhǔn)備底物DAB。將6mgDAB溶于10ml 0.5mol/LTris緩沖液中(pH 7.6),加lml 0.3%W/V的氯化鎳儲(chǔ)存液(或等量的氯化鈷);
加0.1ml的3%H202溶液。30%H202溶液較易獲得,可置4℃保存1個(gè)月;
如出現(xiàn)沉淀,用Whatman 1#濾紙(或類似濾紙)過(guò)濾;
(9)將底物溶液加入樣品。觀察樣品,在背景發(fā)生變化前出現(xiàn)適量黑色沉淀時(shí)終止反應(yīng)。常為1~20min之間。在水中漂洗數(shù)次即可終止反應(yīng)
(10)加入DPX,用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

 

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