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酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定氯霉素CAP殘留

2011-11-01 [2263]

酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定氯霉素CAP殘留

(1)試劑和材料 以下所有試劑除特別注明外,均為分析純?cè)噭?;水為符合GB/T
6682規(guī)定的二級(jí)水。
①0.2mol/L硫酸
②卜葡糖苷酸酶
③乙酸乙酯
④異辛烷
⑤三氯甲烷酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定氯霉素CAP殘留
⑥乙酸鈉
⑦氯霉素檢測(cè)試劑盒(2—8~C冰箱中保存)
(2)儀器和設(shè)備
①酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀數(shù)儀
②分析天平 精度0.00001g
③天平 精度0.01g
④冷凍離心機(jī)
⑤50ml具塞離心管
⑥勻漿機(jī)酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定氯霉素CAP殘留
⑦微型振蕩器
⑧回旋振蕩器
⑨微量移液器
⑩恒溫干燥箱
(3)測(cè)定步驟
①尿樣的制備 取上層用稀釋劑/洗滌緩沖劑稀釋5倍,備片
②肌肉組織(包括魚和蝦)中氯霉素的提取 取38組織,加入6mi的乙酸乙酯,勻漿lmin,在2000r/mln下,離心15min。取上層4mi,在70~C下蒸干。加入2mi的異辛烷:三氯甲烷(2:3)溶解剩余物,旋轉(zhuǎn)lmin。加Rmi稀釋劑/洗滌緩沖劑,再旋轉(zhuǎn)2rain。(如果有乳化現(xiàn)象,把試管放在80~C的恒溫室約20min,直至見到分離層)。再在2000r/min下離心10rain,取上層備用。
③肝/腎中氯霉素的提取 取3s組織,加入3ml乙酸鈉緩沖劑(o.1mol幾,pH 5)和8000U 9—葡糖苷酸酶,勻漿30s,置于37~C的恒溫箱內(nèi)2h。加12ml的乙酸乙酯,勻漿lmin,在2000r/Illin下,離心15min。取上層lml,在70~C下蒸干。加入2ml的異辛烷:三氯甲烷(2:3)溶解剩余物,旋轉(zhuǎn)lmin。加lml稀釋劑/洗滌緩沖劑,再旋轉(zhuǎn)2min(如果有乳化現(xiàn)象,把試管放在80~C的恒溫室約20min,直至見到分離層)。再在2000r/mln下離心10rain,取上層備用。
④測(cè)定。
室溫應(yīng)控制在19—25~C。
取在19~25 0C放置1—2h的試劑盒,按每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液至少兩孔計(jì)算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量,插入框架。每個(gè)微孔加入標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液各25tzL,再在每個(gè)微孔內(nèi)加入酶標(biāo)二抗100t~L,封口膜封板,室溫下孵育1h。
倒出孔內(nèi)液體,將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,使孔內(nèi)沒有殘余液體。加入250/uL稀釋的稀釋劑/洗滌緩沖劑到酶聯(lián)板的微孔內(nèi),稍后倒出孔內(nèi)液體,再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,如此重復(fù)操作洗板6次。
用多道移液器加入底物125tzI。到每個(gè)微IL內(nèi),室溫避光孵育20min。
用多道移液器每孔加終止液o.2mol/L硫酸100ul。
在10min內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標(biāo)儀內(nèi),于450nm波長處測(cè)定吸光度值。
(4)計(jì)算 用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得出試料中氯霉素的含量。
(5)靈敏度和回收率 本方法的檢測(cè)限為:尿樣0,25P8/L,肌肉0.1P8/k8
1.5ug/kg。
本方法在lug/kg添加濃度水平上,回收率范圍為60%~120%。

 

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